Структурные исследования бактериальных гликополимеров Proteus
Бактерии рода Proteus являются распространенной причиной многих инфекционных урологических заболеваний и связаны с образованием почечных камней. Род включает четыре вида, из которых наибольшее медицинское значение имеют P. mirabilis, P. vulgaris и P. penneri (ранее известный как P. vulgaris biogroup I). Штаммы Proteus разделены на более чем 60 серогрупп, однако многие из них, особенно P. penneri, до сих пор не классифицированы. Каждый серологически отличный штамм имеет уникальную структуру липополисахарида внешней мембраны (О-антигена), что создает химическую основу для серологической классификации.
В 1996-2002 я работал в Центре ЯМР ИОХ РАН над ЯМР-спектроскопическим установлением структуры бактериальных гликополимеров Proteus в группе д.х.н. Ю.А. Книреля (в том числе как аспирант под руководством д.х.н. А.С. Шашкова). Наши систематические структурные и иммунологические исследования направлены на выяснение корреляции между структурой О-антигенов и иммуноспецифичностью штаммов, что важно в аспекте возможности создания синтетических диагностикумов, вакцин и иммуностимуляторов. Эти исследования включают установление строения О-специфических полисахаридных цепей в природных липополисахаридах P. mirabilis, P. vulgaris и P. penneri.
Наряду с распространенными в природе углеводными компонентами (Glc, Gal, GlcNAc, GalNAc, GlcA, GalA), в О-антигенах изученных штаммов Proteus обнаружено присутствие редко встречающихся мономеров, два из которых (L-AltpA и L-Rhap2NAc3NAc) обнаружены в липополисахаридах грам-отрицательных бактерий впервые. Из необычных нейтральных мономеров стоит упомянуть L-6dTalp, L-QuipNAc, L-Quip3NAc, D-Fucp3NAc, D-Fucp4NAc и L-Rhap2NAc3NAc, из мономеров, несущих заряд - L-AltpA и D-ManpANAc, амиды уроновых кислот с остатками L-Lys, L-Ala и AlaLys, остаток пировиноградной кислоты R-Pyr, фосфатсодержащие остатки P-EtN и P-Rbo. Три рибит-содержащих О-антигена (P.mirabilis O16, P.mirabilis O33 и P. penneri 103) оказались структурно-подобными тейхоевым кислотам грам-положительных бактерий. Два других фосфорилированных полисахарида (P. vulgaris OX19 и O21) имеют олигосахарид-фосфатное повторяющееся звено, в связи с чем высоко кислотно лабильны. Как и рибитфосфат, гликозилфосфаты ранее не встречались в О-антигенах.
Моя часть работы состоит в установлении структуры изучаемых соединений с помощью спектроскопии ЯМР. В настоящее время спектроскопия ЯМР является единственным методом, позволяющим быстро и бездеструктивно получить информацию о структуре гликополимеров. Приблизительную схему ЯМР-исследования можно посмотреть здесь. Изучение структуры провидилось на спектрометрах фирмы Bruker (WM250, AM300, DRX500) и включало следующие эксперименты:
| Эксперимент ЯМР | Его результат | 1D 13C ЯМР | предварительные данные о структуре, эффекты гликозилирования (=> позиции замещения, абсолютные конфигурации остатков) |
|---|---|
| 1D 1H ЯМР | анализ протон-протонных КССВ (=> мономерный состав, аномерные конфигурации остатков) |
| 1D 31P ЯМР | выявление фосфосодержащих неуглеводных заместителей |
| 1D H-Gated 13C ЯМР | аномерные конфигурации остатков, размеры окисных циклов |
| 1D Attached Proton Test | отнесение сигналов метиленовых групп |
| 2D 1H,1H COSY | выявление вицинальных протон-протонных взаимодействий (=> отнесение спектра 1H ЯМР) |
| 2D 1H,1H Double Quantum Filter COSY | упрощение спектра COSY за счет подавления диагональной линии |
| 2D COSY с переносом когерентности (RCT, RCT2) | выявление дальних протон-протонных взаимодействий (=> отнесение спектра 1H ЯМР) |
| 2D TOtal Correlation SpectroscopY | выделение подспектров спиновых систем (мономеров) из спектра 1H ЯМР |
| 1D 1H разностный двойной резонанс | установление формы сигналов (=> тонкое отнесение спектра 1H ЯМР) |
| 2D 31P,1H COSY | локализация фосфосодержащих заместителей в повторяющемя звене |
| 2D 13C,1H COSY | выявление прямых углерод-протонных взаимодействий (=> отнесение спектра 13C ЯМР) |
| 2D 1H,13C Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence | выявление прямых протон-углеродных взаимодействий и измерение гетероядерных КССВ (=> отнесение спектра 13C ЯМР) |
| 2D Heteronuclear Multiple-Bond Correlation | выявление дальних протон-углеродных взаимодействий, в том числе трансгликозидных (=> последовательность остатков) |
| 2D NOE SpectroscopY | выявление пространственных протон-протонных контактов в олигомерах, в том числе трансгликозидных (=> позиции замещения, последовательность остатков) |
| 2D Rotating frame nuclear Overhauser Effect SpectroscopY | выявление пространственных протон-протонных контактов, в том числе трансгликозидных (=> позиции замещения, последовательность остатков) |
| 1D разностная спектроскопия NOE | тонкий анализ пространственных протон-протонных контактов |
Упомянутые структурные исследования О-антигенов Proteus финансировались грантами РФФИ N93-03-5839, N96-04-50460, N96-15-97380, N99-04-48279 и N00-15-97373.
 Публикации : Proteus |
 Дом : Наука |
Последнее обновление: 2002
Домой